中国人民解放军空军特色医学中心蔡宏获国家专利权
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龙图腾网获悉中国人民解放军空军特色医学中心申请的专利一种日光性皮炎小鼠模型的构建方法获国家发明授权专利权,本发明授权专利权由国家知识产权局授予,授权公告号为:CN117016479B 。
龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-04-28发布的发明授权授权公告中获悉:该发明授权的专利申请号/专利号为:202310963955.6,技术领域涉及:A01K67/02;该发明授权一种日光性皮炎小鼠模型的构建方法是由蔡宏;李博尉;赖成材;方崟骄;梁慧敏;陈奕萱设计研发完成,并于2023-08-02向国家知识产权局提交的专利申请。
本一种日光性皮炎小鼠模型的构建方法在说明书摘要公布了:本发明公开了一种日光性皮炎小鼠模型的构建方法,具体属于动物实验模型实验技术领域,该构建方法包括如下步骤:S01、紫外灯强度测量与选择;S02、日光性皮炎模型的建立;S03、新鲜组织石蜡包埋切片;S04、蜡组织切片分别经H‑E染色实验、Masson染色实验、免疫组化染色实验、透射电镜制片观察,得到取材组织结构特征变化。该构建方法通过控制保持辐射剂量的一致性,从而更大程度地还原实际情况,为开发研究日光性皮炎药物提供了真实可靠的基础。
本发明授权一种日光性皮炎小鼠模型的构建方法在权利要求书中公布了:1.一种日光性皮炎小鼠模型的构建方法,其特征在于,包括如下步骤: S01、紫外灯强度测量与选择 分别于10cm、15cm、20cm处测量紫外灯强度,并选择20cm为本实验紫外线照射强度,UVB剂量mJcm2=UVB强度mWcm2×辐射时间s; S02、日光性皮炎模型的建立 S02.1、将C57BL6小鼠按随机数表法分为5组,分别为0min组、15min组、30min组、45min组、60min组,每组8例动物; S02.2、将上述五组小鼠均麻醉后,用电动剃须刀将小鼠尾部以上,背部以下的毛发剃光,然后用脱毛膏将小鼠背部毛发脱干净,得到实验区; S02.3、静待24小时后,将小鼠的实验区暴露在紫外线灯下20cm处,紫外线强度为0.45mWcm2,0min组、15min组、30min组、45min组、60min组对应的照射时间分别为0min、15min、30min、45min、60min; S02.4、分别于24h、48h、72h拍照观察背部皮肤外观变化后,于UVB下暴露后72h对每只小鼠进行皮肤活检术,取背部1.0cm×0.5cm皮肤组织,分别置于4%多聚甲醛和3%戊二醛中对皮肤组织进行固定; S03、新鲜组织石蜡包埋切片 S03.1、将得到的新鲜组织固定浸泡于4%多聚甲醛进行固定组织标本,浸泡时间至少为24h,浸泡完成后,将新鲜组织取出,并对目的部位组织修平整,将修切好的组织贴上对应的标签后,放于脱水盒内; S03.2、将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次按脱水步骤加入试剂进行脱水,脱水步骤具体为: 依次经75%酒精浸泡4h,85%酒精浸泡2h,90%酒精浸泡2h,95%酒精浸泡1h,无水乙醇I浸泡30min,无水乙醇II浸泡30min,醇苯浸泡5-10min,二甲苯I浸泡5-10min,二甲苯II浸泡5-10min,蜡I浸泡1h,蜡II浸泡1h,蜡III浸泡1h,得到蜡组织; S03.3、将蜡组织于包埋机内进行包埋,先将融化的蜡放入包埋框,待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框,并贴上对应的标签,并于-20℃冻台冷却,蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块; S03.4、将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片,片厚4μm,切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平,用载玻片将组织捞起,并放进60℃烘箱内烤片,待水烤干蜡烤化后取出,得到蜡组织切片; S04、蜡组织切片分别经H-E染色实验、Masson染色实验、免疫组化染色实验、透射电镜制片观察,得到取材组织结构特征变化; S04中,免疫组化染色实验步骤为: 石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min,二甲苯Ⅱ15min,无水乙醇Ⅰ5min,无水乙醇Ⅱ5min,85%酒精5min,75%酒精5min,蒸馏水洗; 抗原修复:石蜡切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复,依次按中火8min,停火8min转中低火7min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片; 自然冷却后将玻片置于PBS缓冲液中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min; 画圈:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈; 血清封闭:在圈内滴加3%BSA室温孵育30min; 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4℃孵育过夜; 加二抗:玻片置于PBS缓冲液中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min;切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,避光室温孵育50min; DAB显色及复染细胞核:玻片置于PBS缓冲液中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min,切片稍甩干后在圈内滴加DAB显色剂,显微镜控制显色,显色完全后,蒸馏水或自来水冲洗,苏木素复染,1%盐酸酒精分化,自来水冲洗,氨水返蓝,流水冲洗; 脱水封片:将切片依次放入75%酒精5min,85%酒精5min,无水乙醇Ⅰ5min,无水乙醇Ⅱ5min,二甲苯Ⅰ5min中脱水至透明,将切片从二甲苯拿出晾干,并用中性树胶封片。
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